[摘要] 目的 探讨固定时间对口腔黏膜鳞状细胞癌组织HE染色和免疫组织化学（immunohistochemistry， IHC）染色的影响。 方法 选取10例患者口腔黏膜鳞状细胞癌组织，每例各取4块，分别固定8 h、24 h、48 h和1周，进行HE染色和高分子量细胞角蛋白（cytokeratin high molecular weight，CKH，克隆号34βE12）和广谱细胞角蛋白（cytokeratin pan，ckpan，克隆号AE1/AE3）IHC染色，观察细胞形态的优良、染色情况及IHC染色的阳性强度和阳性率。 结果 HE染色和IHC染色结果均显示口腔黏膜鳞状细胞癌组织形态和染色、阳性强度和阳性率最佳为固定24 h，8 h为最差。固定1周者染色效果较48 h差。 结论 本研究表明对口腔黏膜鳞状细胞癌组织，24 h为最佳固定时间；组织固定不充分对HE染色和IHC染色的影响要大于固定时间过长的影响；固定时间越长，对HE染色和IHC染色效果影响越大。

　　[关键词] 10%中性甲醛；固定时间；HE染色；免疫组织化学（IHC）交联

　　[中图分类号] R739.8 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2013）04（a）-0007-03

　　10%中性甲醛是处理组织标本最常用的固定剂，具有渗透性好、组织收缩不明显和对大多数抗原保存较好等优点[1]。良好的组织细胞形态和可靠的IHC结果对做出正确的病理诊断至关重要，而对组织进行合适的固定是获得高质量HE染色和IHC染色的前提。国内外关于固定时间对IHC染色影响的报道较多[2-7]，但对HE染色影响的报道很少[8]。除乳腺组织外，10%中性甲醛对组织的固定时间没有一个明确的标准。为更好地了解固定时间对于光镜下组织细胞形态和IHC结果的影响，本研究对一组口腔黏膜鳞状细胞癌标本进行了不同时间的固定，以观察固定时间对口腔黏膜鳞状细胞癌组织HE染色和IHC染色结果的影响，供临床和科研做参考。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　选取2012年7～8月期间，10例在上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔颌面外科手术切除口腔黏膜鳞状细胞癌标本，要求其离体时间30 min内。 所用一抗CKH和CKpan均购自上海太阳生物技术有限公司，均为鼠单克隆抗体。二抗及显色系统为徕卡BOND-MAX全自动免疫组化仪配套试剂。HE染色及IHC染色结果在Olympus（BX-51）光学显微镜下观察。

　　1.2 方法

　　1.2.2 固定时间和标本取材 新鲜组织标本，大小1 cm×1 cm×0.3 cm，各取4块，室温下分别固定8 h、24 h、48 h和1周，体积比20∶1。

　　1.2.3 组织脱水 各时段组织标本固定完毕后，流水冲洗30 min，之后在Sandun全自动脱水机里进行相同条件的脱水处理程序。

　　1.2.5 HE染色及IHC染色 所有标本同时进行HE染色和免疫组织化学染色。 HE染色按常规步骤进行。免疫组织化学染色在徕卡全自动免疫组织化学染色仪上完成，之后脱水透明中性树胶封片。光镜下观察。

　　2 结果

　　2.1 HE染色

　　2.2 IHC染色

　　3 讨论

　　3.1 HE染色

　　甲醛是一种蛋白交联剂，可以通过交联稳定细胞的自然状态。固定充分时，通过分子间交联，可以使组织细胞形态不会受某些化学或者物理因素影响（包括组织脱水、烤片等）而改变。如果固定不充分，脱水处理时，在组织周围为无水的情况下，疏水基团会转向外，而水分子会存在于亲水基团的内部，造成一个疏水倒置的状态，水分子再通过H键的结合与大分子等打结， 这种疏水倒置的情况反映在光镜下可以表现为细胞核模糊、褪色、染色质结构较差和胶原区域异常染色等，因此固定充分对维持组织细胞形态结构非常重要[8]。固定是一个化学反应的过程，需要一定时间，尽管组织大小不同但固定时间应该大致相同。中性甲醛的渗透速度为1 mm/h，而渗透距离（d）却和时间（t）的平方根成正比（d=k）[9]，说明4 mm组织需8 h才能完全渗透，但合适的交联却需要24 h或更久[2，10]，因此固定充分应至少需24 h。有研究认为脂肪组织需要约48 h固定才能获得质量良好的切片[11]，乳腺组织需要24 h，也有研究认为皮肤和肝脏组织也需要固定48 h[9]，这些结果提示不同的组织可能需要不同的时间才能充分固定。有关口腔黏膜鳞状细胞癌组织所需合适的固定时间还没有相关报道，本研究首次对此进行了探讨，结果表明固定24 h后HE染色效果最好，对比度明显，细胞核形态规则，核仁清晰。固定8 h和1周则效果明显较差。这是由于固定8 h时，交联不充分，不足以稳定细胞的自然状态，难以抵抗脱水等因素的影响，导致组织收缩等。而固定1周达不到理想效果，可能和交联过于密集有关，固定时间越长，交联可能不单发生在蛋白与核酸之间，交联之间也有可能发生打结，造成组织进一步收缩。如需在固定较短时间内得到效果较好的HE染色效果，可以在45℃下进行加压和搅拌固定10 h，来加快交联速度，来达到理想的染色效果。

　　3.2 IHC染色

　　甲醛类固定剂对IHC染色产生影响可能通过以下三个方面的原因[5-12]：（1）广泛的交联阻止了一抗渗透到目的抗原决定簇；（2）甲醛与目的抗原决定簇的反应降低了免疫反应；（3）甲醛与抗原之间的反应导致蛋白质二级结构发生改变从而降低免疫反应。杨毅等[12]研究发现，胃壁组织固定10年后，通过合适的抗原修复，一些抗原仍可检测到。唐志佼等[13]认为对淋巴组织固定6～12 h比较合适。ASCO/CAP建议乳腺组织固定时间不要超过48 h，至少要8 h，才能得到可靠的免疫组化结果。不同的组织进行IHC染色需要的固定时间也有可能不同，本研究表明口腔黏膜鳞状细胞癌组织固定24 h时CKH的染色效果最好，固定8 h和1周则效果明显较差。固定不充分时，交联也不充分，疏水倒置的发生有可能会影响抗原决定簇不与一抗相结合[8]。而固定时间延长至1周时，由于甲醛与目的抗原决定簇之间的反应更加牢固，交联越紧密，可能需要更强的抗原修复才能打开交联。而对于CKpan，不同的固定时间组未发现有明显差异，表明对于不同的抗体固定时间可能有着不同的影响。 　　综上所述，本研究表明，对于口腔黏膜鳞状细胞癌组织，固定时间以24 h为宜，不要超过48 h。当然，由于本研究标本量和所用抗体有限，本研究的结果存在一定的局限性，有待进一步扩大样本来深入研究。

　　[参考文献]

　　[1] 蔡文琴，王伯纭，等。 实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术[M]. 成都：四川科学技术出版社，1994：14-16.

　　[2] Werner M，Chott A，Fabiano A，et al. Effect of formalin tissue fixation and processing on immunohistochemistry[J]. Am J Surg Pathol，2000，24：1016-1019.

　　[3] Webster JD，Miller MA，DuSold D，et al. Effects of prolonged formalin fixation on the immunohistochemical detection of infectious agents in formalin-fixed， paraffin-embedded tissues[J]. Vet Pathol，2010，47：529-535.

　　[4] Van Maldegem F，De Wit M，Morsink F，et al. Effects of processing delay，formalin fixation，and immunohistochemistry on RNA Recovery From Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Sections[J]. Diagn Mol Pathol，2008，17：51-58.

　　[5] Grizzle WE. Special symposium： fixation and tissue processing models[J]. Biotech Histochem， 2009，84：185-193.

　　[6] Arber DA. Effect of prolonged formalin fixation on the immunohistochemical reactivity of breast markers[J]. Appl Immunohistochem Mol Morphol，2002，10：183-186.

　　[7] Webster JD，Miller MA，Dusold D，et al. Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals[J]. J Histochem Cytochem，2009，57：753-761.

　　[8] Dapson RW. Macromolecular changes caused by formalin fixation and antigen retrieval[J]. Biotech Histochem， 2007，82：133-140.

　　[9] BuesaRJ. Histology without formalin？[J]. Ann Diagn Pathol，2008，12：387-396.

　　[10] Ibarra JA RL，Kyshtoobayeva A， Bloom K. Fixation time does not affect the expression of estrogen receptor[J]. Am J Clin Pathol，2010，133：747-755.

　　[11] Buesa RJ PM. How much formalin is enough to fix tissues[J]. Ann Diagn Pathol，2012，16：202-209.

　　[12] 杨毅，陆江阳。 标本固定时间对免疫组化染色结果的影响[J]. 诊断病理学杂志，2005，12：233-234.

　　[13] 唐志佼，熊永炎。 固定液种类和固定时间对免疫组化染色的石蜡切片中抗原检测效果的影响[J]. 湖北医科大学学报，1995，16：204-205.

　　（收稿日期：2012-11-08 本文编辑：魏玉坡）